<em id="pzjrf"></em>
<sub id="pzjrf"><listing id="pzjrf"><listing id="pzjrf"></listing></listing></sub>

    <span id="pzjrf"></span>

    <form id="pzjrf"></form>

      <address id="pzjrf"><nobr id="pzjrf"><meter id="pzjrf"></meter></nobr></address>

        <noframes id="pzjrf">
        IMG_6708

        TRIzol Total RNA Extraction Reagent (R201)

        产品简介

        基于异硫氰酸胍和酚,具有极强的裂解能力,可在短时间内裂解细胞和组织样本,保证RNA的完整性。本产品广泛适用于培养细胞、动物组织、微生物,以及次生代谢较少的植物组织,如幼苗、幼叶等。样品在RNA isolater中能够充分被裂解,在加入氯仿离心后,溶液会形成上清层、中间层和有机层(鲜红色下层),RNA分布在上层水相中,收集上清层后,经异丙醇沉淀便可以回收得到Total RNA。

         

        产品组分

        R201

        TRIzol Total RNA Extraction Reagent

        100 ml

         

        保存条件

        4℃避光保存

         

        自备材料

        氯仿,异丙醇,75%乙醇(DEPC水配制),DEPC

         

        实验方案

        (1)实验流程概览

        组织

        培养细胞

        TRIzol Total RNA Extraction Reagent里匀浆或在液氮里研碎,用TRIzol Total RNA Extraction Reagent溶解

        加入TRIzol Total RNA Extraction Reagent

        用移液器吹打裂解

        加入0.2 ml氯仿 / 1 ml TRIzol,剧烈混匀,4℃静置5 min

        12,000 g 4℃离心15 min

        吸取上清,加0.5 ml异丙醇 / 1 ml TRIzol,4℃静置10 min

        12,000 g 4℃离心10 min

        1ml 75%乙醇/ 1 ml TRIzol,洗涤

        12,000 g 4℃离心5 min

        弃上清,晾干;溶解沉淀

        电泳检测完整性分光光度计检测纯度和浓度

        图一:实验流程概览

         

        常见问题与解决方案

        1RNA降解

        如果使用者确定提取RNA的试剂/器具没有问题,RNA的降解通常发生在样品破碎/匀浆阶段。RNA提取实际上是一个将样本破碎匀浆,打破细胞结构,让RNA释放到一个液相体系中,再将其抽提出来的过程。样品离开活体或者原来的生长环境后,样品中的内源RNase开始降解RNA,降解速度与内源RNase的含量及温度有关。

        有两个方法可以彻底抑制内源RNase活性:①立即加入裂解液并且彻底、迅速地匀浆。这只适合培养细胞及内源RNase含量较低并且较容易匀浆的组织;②对于内源RNase含量高或不易匀浆的组织,如肝脏、胰腺、脾脏、肌肉等,或植物组织,需要切成小块后立即投入液氮冷冻,再按06-3中动物/植物组织的说明进行破碎/匀浆。样品彻底破碎匀浆后,RNA isolater就可以与游离出来的RNA充分接触,?;?/span>RNA不受降解。特别注意,在整个研磨过程中,样品不得融化,因为冷冻过的样品内会形成冰晶,破坏细胞内部结构,使内源RNase更容易起作用。

         

        2)组织样本应该如何保存?

        如果不能立刻提取RNA,应将组织离体后迅速投入液氮冷冻,并用液氮保存;或待冻结后,转移至-80℃保存。注意:不能直接将新鲜组织放在-80℃冷冻,否则样品的冻结会是一个缓慢的过程,在这个过程中内源RNase足以将RNA降解。也将新鲜组织充分浸泡在ATG™ RNA Stabilization Solution (ATG #R202)中,可在室温存放一周,4℃存放一个月或-20℃/-80℃长期保存。

         

        3)提取的RNA有基因组污染。

        向裂解液中加入氯仿后,需要在低温下(2-8℃)高速离心。离心后,RNA被抽提到上层的水相中,中、下层是有机相,含有氯仿。DNA即存在于中层。氯仿在常温下会与水以一定的比例互溶,因此,常温离心会导致上层水相中也有少量基因组DNA污染。吸取上层液时,应非常小心,避免吸到中间层和下层,为此牺牲一点得率,保留一些上清不吸,是非常值得的。

         

        4)加入异丙醇离心后看不见沉淀。

        RNA含量可能较低。建议加入异丙醇后在4℃-20℃放置10-30 min后再离心。若还看不见沉淀,那么在后面弃上清的操作时,采用吸取而不是倾倒的方法,以免沉淀丢失。

         

        5RNA应该如何保存?

        建议分装后在-80℃长期保存。在-20℃可以短期保存,但应尽快使用。

         

        6RT-PCR反应失败。

        RT-PCR是多步反应,应首先检查反应体系。在确认PCR以及逆转录反应体系没有问题的情况下,RNA降解是导致实验失败的最主要的原因。

        通常RNA在提取过程中发生降解,并随着保存时间的延长,降解程度会不断增强。取少量新鲜提取或冻存的RNA1%琼脂糖凝胶电泳,检验完整性。以哺乳动物细胞/组织为例,完整的总RNA在胶上能看见清晰的三条带,分子量从大到小分别为28 s、18 s、5 s;若能看见三条带,但带型模糊或弥散,则说明RNA有部分降解,建议立即进行逆转录反应,并适量增大模板量。若无法立即进行逆转录,可在保存体系中加入5% (v/v) ATG™ Rnasin   (ATG #RC102),可有效抑制RNA在存放过程中的降解。若只能看见分子量很小的一条带或没有条带,则说明RNA已完全降解,需要重新提取。

        此外,RNA的纯度也会影响后续反应。TRIzol Total RNA Extraction Reagent提取RNA是基于异硫氰酸胍法,主要的杂质来自于异硫氰酸胍等盐的残留,对后续酶反应可能存在影响。因此需要用75%乙醇(DEPC水配制)重复洗涤沉淀 (轻弹管底让沉淀悬浮,并静置数分钟)。

        500彩 <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <文本链> <文本链> <文本链> <文本链> <文本链> <文本链>