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        R116

        ATGScript? One Step RT-qPCR U+ Probe Kit (R116)

        ATGScript™ One Step RT-qPCR U+ Probe Kit R116

         

        产品简介

        ATGScript U+ One Step RT-qPCR Probe Kit专为以RNA为模板(如RNA病毒)的定量PCR检测而设计,使用基因特异性引物(GSP),逆转录和qPCR反应在一管内完成,不需要额外的开管移液操作,大大提高了检测通量,并降低了污染的风险。本试剂盒中引入了 dUTP/UDG 防污染系。热敏感(Heat-labileUDG在室温下即可将含U的污染物速解:55 ℃逆转录时,Heat-abie UDG迅速失活,不会影响RT-qPCR的效率和灵敏度。整合ATGScript Reverse Transcriptase以及热启动的ATGStart Taq DNA Polymerase的优越性能,配合经过优化的缓冲体系,ATGScript U+ One Step RT-qPCR Probe Kit的检测灵敏度可达到0.1 pgRNA<10拷贝的RNA模板。试剂盒以便捷的 Master Mix形式提供。2 × one Step U+ Mix 包含优化的缓冲体系和dNTP / dUTP Mix,适用于 TaqMan等荧光标记探针的高特异性检测系统。

         

        产品组分

        a. 包含 dNTP/dUTP Mix,Mg2+

        b. ATGScriptTM Reverse Transcriptase、RNasin、UDG酶以及热启动的 ATGStartTM Taq DNA Polymerase。

        c. 用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差,使用ABI7900HT/7300Real-Time PCR SystemStep One Plus时使用50 × ROX Reference Dye 1;ABI7500,7500Fast Real-time PCR System,Stratagene Mx3000P使用50 × ROX Reference Dye2; Roche,Bio-Rad Real Time PCR仪不必使用ROX。

         

        保存条件

        20℃保存

         

        质量控制

        所有组分经检测均无核酸外切酶、核酸内切酶及 RNase残留。

        功能测试:以HeLa细胞总RNA为模板,1 pg–1 ug起始量中的4个浓度梯度,扩增三个不同丰度基因扩增效率在0.9-1.1之间,且模板量为1 pgB2M基因的CT值在35以内。

         

        注意事项

        1. One Step RTq U+ Enzyme Mix含有高浓度的甘油,使用前请短暂离心,收集到反应管底部并用移液枪轻轻吸打,充分混匀后准确吸取。

        2.反应液的配制请使用RNase-free枪头EP管等,尽量避免污染。

         

        实验流程

        1 在RNase-free离心管中配制如下混合液

        反应体系中各成分的量可根据以下原则自行调整:

        一般来说反应体系中引物终浓度为0.2 μM即可得到较好的扩增效果。当反应性能比较差时,可以在0.1-1.0 μM范围内调整引物浓度。

        探针终浓度可以在50 nM-250 nM之间调整。

        ▲PCR灵敏度极高建立反应体系时加入模板量的准确程度对最终定量结果会有很大的影响。推荐将模板稀释后(如稀释至25 μl/样本)加入反应体系中,这样可以有效提高实验的重复性。

        扩增产物长度请选择在80 bp-200 bp范围内

         

        2 按下列条件进行One Step qRT-PCR反应

         

        标准程序(可获得最高的扩增灵敏度)

         

        快速程序(可满足大部分应用)

        a.对于具有复杂二级结构或高GC区域的模板,将逆转录温度提高到55 ℃,有助于提高扩增效率和灵敏度。

        b.延伸时间请根据您使用的Real Time PCR仪所需要的数据采集最短时间限制自行调整:使用ABI 77007900HT时至少30秒:使用ABI 70007300时至少31秒:使用ABI 7500时至少34秒。

        c实际使 Real Time PCR仪是否支持快速扩增循环,初次尝试请进行预实验确认。

         

        3 反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线,进行标准曲线制作等。

         

         

         

         

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