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        R102

        ATGScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit ( R102 )

        产品简介

        ATGScript™ Reverse Transcriptase是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基础上经过饱和定点突变得到的全新逆转录酶。经过热点突变,ATGScript™ Reverse Transcriptase具有更高的热稳定性,使其可用于具有二级结构的RNA模板的逆转录,并可获得更多全长的cDNA。并且ATGScript™ Reverse Transcriptase的错配率比M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase大幅降低,提高了克隆的保真度。通过优势组合突变增强了其与模板的亲和力,特别适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。

         

        ATGScript™ 第一链cDNA合成试剂盒基于ATGScript™ Reverse Transcriptase,包含合成高质量第一链cDNA所需的所有成分,适合于后续的PCR、qPCR以及PCR克隆。2 × RT Mix包含优化的缓冲体系和dNTP;Enzyme Mix包含ATGScript™ Reverse TranscriptaseRNasin??筛菪枰?,选择Oligo (dT)23VN 、Random hexamers或基因特异引物作为逆转录引物。

         

         

        产品组成

        R201 50rxn (20μl/rxn)

        RNase free ddH2O

        1 ml

        2 × RT Mix*1

        500 μl

        ATGScript™ Enzyme Mix*2

        100 μl

        Oligo (dT)23VN (50 μM)

        50 μl

        Random hexamers (50 ng/μl)

        50 μl

        *1. 包含1 mM each dNTP

        *2. 包含RNasin

         

        储存条件

        -20℃保存。

         

         

        实验方案

        后续实验为PCR

        1. RNA模板变性

        RNase-free离心管中配制如下混合液:

        RNase Free ddH2O

        to 8 µl

        Oligo (dT) 18 Primer(50 µM)

        1 µl

        Or Random Hexamers (50 ng/µl)

        Or Gene Specific Primers GSP (2 µM)

        Total RNA

        1 pg-5 µg

        Or Poly* RNA

        10 pg-500 ng

         

        65℃ 加热5 min,迅速置于冰上骤冷,并在冰上静置2 min以上。

        离心数秒后,进行后续配制。

        *对于长度超过3 kbcDNA片段,请勿省略变性步骤。

        1. 配制第一链cDNA合成反应液

        上一步的混合液

        8 µl

        2 × RT Mix

        10 µl

        ATGScript™ Enzyme Mix

        2 µl

        用移液器轻轻吹打混匀。

         

        1. 按下列条件进行第一链合成反应

        使用 Oligo (dT)23VN

        42℃

        45min*

        85℃

        5min

         

        使用Random hexamers

        25℃

        10min

        42℃

        45min*

        85℃

        5min

         

        使用Gene Specific Primers

        42~50℃

        45min*

        85℃

        5min

        * 可在30-60 min间调整。延长逆转录时间可能有助于获得更长的cDNA (>5 kb)。

         

        后续实验为qPCR

        1. 配制第一链cDNA合成反应液

        RNase-free离心管中配制如下混合液:

        RNase Free ddH2O

        to 20 µl

        2 × RT Mix

        10 µl

        ATGScript™ Enzyme Mix

        2 µl

        Oligo (dT)23VN Primer(50 µM)

        1 µl

        Random Hexamers (50 ng/µl)

        1 µl

        Total RNA

        1 pg-1 µg

        Or Poly* RNA

        10 pg-100 ng

         

        1. 按下列条件进行第一链cDNA合成反应

        25℃

        10min

        42℃

        45min*

        85℃

        5min

        产物可立即用于qPCR反应,或在-20℃保存,并在半年内使用;长期存放建议分装后在-80℃保存。cDNA应避免反复冻融。

         

        注意事项

        引物选择

        后续实验为PCR

        1)如果模板为真核生物来源,一般情况下首选Oligo (dT)23VN,与真核生物mRNA3’ Poly A尾配对,可获得最高产量的全长cDNA。

        2)基因特异性引物(GSP)的特异性最高。但有些情况下,用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成。这时,可改用Oligo (dT)23VNRandom hexamers重新进行逆转录。

        3Random hexamers特异性最低,所有RNA,包括mRNA,rRNA,tRNA均可以作为Random hexamers的模板。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高,或者模板为原核生物来源,使用Oligo (dT)23VN或基因特异性引物(GSP)无法有效引导cDNA合成时,可使用Random hexamers为引物。

         

        后续实验为qPCR

        1)将Oligo (dT)23VNRandom hexamers混合使用,可使mRNA的各个区域cDNA合成效率相同,有助于提高定量结果的真实性和重复性。

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